稳转细胞系构建方法

1. 抗生素敏感性测试

       1.1 从二氧化碳培养箱中取出细胞，镜下观察细胞生长状态，胰酶消化后计数，2*10^5/孔，铺24孔板，37℃培养过夜，浓度预设为：0 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、10 μg/ml，不同细胞对于抗生素敏感性不同如未测试出合适的puro可提高puro梯度浓度。

       1.2 根据细胞生长状态，2-3天更换完全培养基，并加入对应浓度的puro，持续观细胞状态，一般在4~6天内确定有效杀死非转染细胞的药物最低浓度。

2. 病毒液感染细胞

       2.1 首先进行目的质粒的转染，包装慢病毒，收集病毒液。

       2.2 从二氧化碳培养箱中取出细胞，镜下观察细胞生长状态，胰酶消化后计数， 2~4*10^5/孔细胞量，铺于12孔板，加入50ul的病毒液，隔天更换新鲜培养 基培养24h后。加入确定有效杀死非转染细胞的puro药物浓度筛出转染细胞， 此时细胞为多克隆细胞。并验证是否过表达，每种细胞系的验证实验不同，根据实际进行实验。

3. 单克隆筛选

       3.1 多克隆细胞经验证后进行单克隆筛选，可通过有限稀释法，稀释至50个细胞 /10ml在96孔板中，每孔100μL。单克隆增殖后再进行验证，选出表达量较高的单克隆细胞扩大培养并冻存。