3D细胞培养

1. 实验前准备

1.1 细胞复苏：

根据客户需求，复苏相关的细胞。每个细胞的复苏和培养均按照相关SOP执行。细胞复苏后，培养3-5天后，细胞活率达到>95%后可以用于细胞增殖实验。

1.2 制备试剂：

1.2.1 制备 2x 细胞培养基：将 2 g RPMI 1640粉末培养基溶解在去离子水中，定容至100ml，将此介质通过 0.22 μm 过滤器进行消毒，加入20%的FBS和2%的双抗，4℃存放，有效期一个月。

1.2.2制备琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖加入50ml去离子水，制成1%的琼脂糖溶液；称取0.3g琼脂糖加入50ml去离子水，制成0.6%琼脂糖溶液；三角瓶用封口膜和橡皮筋封住，微波炉加热30s拿出摇匀，再加热至沸腾澄清。灭菌锅121℃灭菌30min，4℃冰箱保存，有效期一个月，需要时微波炉加热至澄清即可。

2. 操作流程

2.1底层琼脂铺板：

2.1.1微波炉加热1%和0.6%的琼脂糖凝胶至澄清透明，放入37℃水浴锅降至恒温；2×1640完全培养基水浴锅预热至37℃。

2.1.2取1%琼脂糖溶液和2×培养基1：1混匀，每孔70μl，注意移液枪不要完全按下，避免气泡产生，操作台内静置30min至琼脂糖凝固。

2.2上层琼脂糖铺板：

      2.2.1将目的细胞消化离心以后重悬计数，用2×培养基稀释到所需浓度，一般96孔板每孔铺500~1000个细胞。

      2.2.2将0.6%琼脂糖溶液和细胞悬液1：1混匀，加到凝固的96孔板中，每孔140μl，注意移液枪不要打到底，避免气泡产生，在操作台内静置40min至混合琼脂糖凝固。

2.2.3在细胞周围一圈的孔中加入280μl PBS溶液。

2.3上层培养基补液：

琼脂糖凝固以后，每孔补加50μl 1×1640完全培养基，每3d补液或换液一次。

3. 给药和CTG检测

3.1观察细胞是否长成单克隆，这个过程需要1周左右；

3.2按客户要求加药处理培养，按照相关SOP严格执行；

3.3从-20℃拿出以及分装的CTG室温解冻，将96孔板从培养箱拿到室温平衡1hr；

3.4加入60μl CTG，摇床避光2h，用排枪混匀，吸出100μl至白底96孔板，用酶标仪读数；

3.5数据分析。