慢病毒载体的包装与转染

1 取状态良好的293-T细胞，8 x10^5 cells/ 2.5ml/well铺于六孔板中，37℃恒温培养箱过夜培养。

2 待细胞汇合度到60-70%，换液，去除完全培养基中的双抗P/S。

3 换液1h后，lipo2000脂质体转染。

4 按如下步骤准备转染试剂：

a) 取2个5 mL的无菌离心管，分别标记X-a, X-b,

b) 往每个离心管中加入250 uL （250 uL）的Opti-MEM；

c) 往X-a 中按照下面的比例加入DNA：（2孔）

d) 往X-b,中加入20 uL的Lipofectamine 2000, 轻柔混匀后，室温放置5 min;

e) 然后相应的a管中DNA溶液（逐滴滴加）转移到b管中，轻摇混匀；室温放置20 min

f) 向6-孔板中每个孔中加入250 uL的混合溶液，轻微摇动后，放回培养箱继续培养；6h后更换成完全培养基后继续培养48 hr；（孔板侧放吸取上清，沿壁缓慢加入，防止293T被吹起。）

g) 48hr后收集培养基上清，并添加2.5 mL完全培养基继续培养；

h) 将收集到的上清500g，10 min离心；

i) 取上清与5X慢病毒浓缩试剂以4:1的比例进行混合，每30 min轻柔混匀一次；混匀3次后，放入4度冰箱保存；一般可以保持一周左右；

j) 到72 hr，继续收集培养基上清，并按照上述步骤浓缩收集病毒；并将48hr的上清液与72 hr上清液混合后离心（混合后病毒滴度会降低，可分开离心）；离心条件为4度，4000 g，25 min；

离心后小心去除上清，一般可见白色沉淀（有时沉淀不可见），加入适量体积（原上清液体积的 1/10-1/100的PBS；小心吹打重悬；按照50 uL/管分装，-80℃ 冰箱保存。