制备流式细胞仪检测样品

  1.1 贴壁细胞样品制备

   1.1.1 将细胞上清吸出用PBS清洗2次，加入少量的（铺满细胞培养皿底部）10 mM EDTA溶液温和消化贴壁细胞，放入培养箱约5min，在显微镜下观察，见细胞变圆时，用3 %FBS-PBS吹打均匀后收集细胞，1000rpm，5min离心，离心后再用3 %FBS-PBS清洗1次，收集细胞沉淀置于冰上。

 1.1.2. 配制一抗溶液：按照抗体说明书上的稀释比例进行稀释， 每1×10^6个细胞/100μl一抗孵育，冰上孵育40min，孵育过程中可适当轻柔混匀。

 1.1.3. 用1ml冰预冷的3 %FBS-PBS洗涤细胞2次， 4℃，1000rpm，5min低温离心，收集沉淀。

 1.1.4. 配制二抗溶液：按照抗体说明书上的稀释比例进行稀释，每1×10^6个细胞/100μl二抗孵育，冰上避光孵育30 min。孵育过程中可适当轻柔混匀。

 1.1.5. 用冰预冷的3 %FBS-PBS 清洗细胞，4℃，1000rpm，5min低温离心，收集细胞沉淀，每个沉淀重悬于300 uL冰预冷3 %FBS-PBS中，然后放置在冰上，避光，准备上流式进行样品分析。

1.2 脾细胞的样品制备

 1.1.1 用无菌手术剪剪碎脾脏组织；

 1.1.2 将细胞滤网置于50 mL离心管上，用2 mL RPMI 1640完全培养基润洗一遍滤网；

 1.1.3 将上清液和脾脏组织从培养皿转移至滤网上，用无菌注射器扁平末端以温和画圆方式研磨脾脏5次，以释放细胞；

 1.1.4 用3 mL RPMI 1640完全培养基冲洗滤网，400×g 离心5 min以收集细胞，弃上清；

 1.1.5 加入2 mL 红细胞裂解液混匀后，静置1分钟，400×g 离心 5 min，弃上清；

 1.1.6 加入RPMI 1640完全培养基后重悬细胞，过细胞滤网，进行细胞计数；

  计数后按照贴壁细胞样品制备的抗体孵育进行实验操作。