细胞培养的基本操作

1. 复苏

1.1 打开水浴锅调到 37℃；把 50ml EP 管和 T75 培养瓶喷酒精后放生物安全柜灭菌， 培养基放入水浴锅中预热；

1.2 从预热好的培养基喷酒精后放在生物安全柜，取出 10ml 在 50ml EP 管中，再取 15ml 培养基加入 T75 培养瓶；

1.3 自液氮罐中取出细胞，立即放入 37℃的水浴锅中快速解冻使其在 2min 内全部融 化，喷酒精迅速拿到生物安全柜中；

1.4 把细胞转移至加了 10ml 培养基的 50ml EP 管中，缓慢加入摇匀，800rpm/5min(室 温离心)；

1.5 离心后喷酒精弃上清，从 T75 培养瓶中取出适量培养基吹打沉淀使细胞悬浮，转 移至培养瓶中盖紧，放入 CO2培养箱中培养。转移至培养瓶中标记好细胞名称、时 间、操作人；

2. 消化传代

2.1 打开水浴锅调到 37℃，生物安全柜灭菌，培养基、胰酶、PBS 放水浴锅中预热；

2.2 从 CO2培养箱中取出培养瓶放在生物安全柜中，倒掉培养瓶中的培养基，加 10 ml PBS 洗 2 遍；

2.3 加适量胰酶在培养瓶内，放置 CO2培养箱消化 3min 左右；

2.4 从培养箱中取出培养瓶在显微镜下观察，细胞变圆呈流动形态即加培养基吹打终止 消化,离心弃上清，加入新的培养基吹打混匀，转移到培养瓶中，加培养基铺平培 养瓶底面；

2.5 传代需要根据细胞生长情况和密度，通常按照 1：2 到 1：6 的比例传代培养。在 细胞培养瓶上面标记好细胞名称，代数，传代时间，操作者姓名；

3. 用细胞计数器计数

3.1 将消化好的细胞按 1:1 的体积和 0.2%台盼蓝混合，滴加 20 μl 在计数板凹槽中；

3.2 凹槽和指示灯相对，打开计数软件，编辑好名称时间选好参数，一分钟后开始测量；

3.3 采样 3 次，系统自动计算平均值并保存；

3.4 测量结束后，把计数板取出放在原装带中下次使用，如果 5 个样本都测量完即丢 弃，然后关掉电脑和仪器；

4. 冻存

4.1 冻存细胞前先观察细胞生长情况，简称细胞是否仍保有其特有性质，欲冷冻保存 的细胞应生长良好且存活率高，贴壁细胞覆盖率约为 80%-90%。细胞浓度为 1～5 ×106 cells/ml；

4.2 配制细胞冻存液：根据每种细胞 ATCC 所建议的冻存条件配制冻存液。常见冻存液 为 75% 培养基+20%FBS+5%DMSO 或者正常生长培养基+10%DMSO，充分颠倒混匀，置 于 4 度待用。 冷冻盒中加入 250ml 的异丙醇，置于 4℃待用；

4.3 消化后的细胞计数后算出冻存管数，配置冻存液，制成细胞悬液；

4.4 将细胞悬液转移至冻存管中 1ml/管。标记好细胞名称，代次，冻存时间和操作人 员；

4.5 将冻存管立即置于加异丙醇的冷冻盒中，放-80℃过夜，第二天将细胞转移至液氮 罐中保存，记录冻存位置；

4.6 为保证冻存细胞的存活率，第三天从液氮中取出一管复苏，观察细胞的活率，细胞 状态良好则冻存细胞可用；