细胞增殖实验

1 细胞复苏培养

1.1 根据客户需求，复苏相关的细胞。每个细胞的复苏和培养均按照相关 SOP 执行。细胞复苏后，培养 3-5 天后，细胞活率达到>95%后可以用于细胞增殖实验。如果客户的实验是同一个化合物多个细胞系进行筛选的话，则细胞培养使用 25 cm²的培养瓶；如果是使用同一个细胞系对多个化合物进行筛选的话，可使用 75 cm²的细胞培养瓶进行培养。

2 细胞接种

2.1 细胞经 Trypsin 消化收集后，进行细胞计数。然后按照每孔 4000 个细胞/100 μL 进行接种于 96-孔白色微孔板。接种时微孔板布局如 Figure 1 所示。接种时，细胞需要均匀混合后，倒到加样槽中，然后使用多通道移液器，将细胞加到微孔板中。将微孔板在生物安全柜中静置 20min，然后转移到 CO₂培养箱中。

注意：

1) 在微孔板的周边孔中加入 PBS 即可，以降低边缘效应；

2) 细胞加入到微孔板中后尽可能保持微孔板静置，以免细胞分布不均匀；

3) 开关 CO2培养箱时尽可能轻柔，以免震动细胞。

3 化合物溶液准备及加样处理

3.1 10 mM DMSO stock solution 的配制

称取合适的量的化合物，配制 10 mL DMSO 储存液。配制后注意观察是否有沉淀，如果有沉淀，可以通过震荡或者用吹风机加热的方式进行溶解。如果化合物在 DMSO中的溶解度小于 10 mM，则可以考虑将化合物进一步稀释到 5mM。配置后的储存液根据需要进行分装后，放置于-20℃保存。

注意：DMSO 需要使用至少 HPLC 级别或者生物实验级别的 DMSO，并且避免反复打开。 DMSO 具有吸水性，反复打开可能导致 DMSO 中水分子增加，降低化合物的稳定性。

3.2 化合物梯度稀释溶液配制（Serial Dilution in DMSO）（以起始终浓度为 10 μM 为例）

3.2.1 取一个洁净无菌的 V 形底或者 U 形底的 96-孔微孔板放置于生物安全柜；

3.2.2 首先在 B2 孔中加入 8 μL 的 DMSO，在 B3-B11 孔中加入 10 μL 的 DMSO；

3.2.3 然后取 12 μL 10 mM 的化合物储存液加入到 B2 孔中，上下吹打 10 次进行混匀；此时

B2 孔中化合物的浓度为 6 mM, 100% DMSO；

3.2.4 如果有多个化合物，则分别在 C2-G2 孔中按照上述两个步骤进行准备相关的化合物溶液；

3.2.5 从 B2-G2 孔中取 5 μL 化合物溶液，转移到 B3-G3 中，上下吹打 10 次，进行混匀；

3.2.6 然后依次稀释，直至稀释至 B10-G10；稀释后化合物微孔板的布局如下 Figure 2 所示。

3.3  6X 化合物溶液的配制 （Preparation of 6X compound solution in culture media）

3.3.1 取一个洁净无菌的 V 形底或者 U 形底的 96-孔微孔板放置于生物安全柜；

3.3.2 在 B2-G11 的每个孔中加入 99μL 的细胞培养基；

3.3.3 用 12 通道移液器从步骤 3.2 中配制的化合物溶液加入到对应的孔中，每孔加入 1 μL；

3.3.4 在周边各孔中加入 100μL PBS。

3.4 化合物处理细胞

3.4.1 将前一天接种的细胞培养板从培养箱中取出；

3.4.2 用 12 通道移液器将 3.3 步骤中配制的化合物溶液吹打混匀；

3.4.3 从每孔取 20 μL 化合物溶液加入到对应的细胞培养孔中，加样时选择最低移液速度，贴壁并避免接触培养板底部；

3.4.4 轻轻振荡细胞培养板以混匀化合物溶液，然后将细胞培养板放回培养箱中继续培养 72hr。