血浆蛋白结合实验

1. 化合物方法的建立

1.1 质谱的方法建立：先配置1μM的浓度溶液和500nM的浓度溶液（含内标）待用；根据样品的分子量确定化合物的分子离子峰，优化质谱参数；

1.2 液相的方法建立：使用梯度洗脱的方式，选择适合的流动相，色谱柱及洗脱梯度，对化合物进行梯度洗脱。

2. 实验的准备工作

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2.1 配置PB溶液：0.5M 磷酸二氢钾溶液，MW=136.09g/mol:在200mL的纯水中加入13.609g的磷酸二氢钾粉末，至澄清，保存在4℃冰箱中 待用；0.5M 磷酸氢二钾溶液，MW=228.23 g/mol：在200mL的纯水中加入13.609g的磷酸氢二钾粉末，至澄清，保存在4℃冰箱中 待用；

2.2 取41mL的0.5M磷酸二氢钾溶液、159mL的0.5M磷酸氢二钾溶液混合，用纯水定量至1000mL，至澄清，保存在4℃冰箱中待用；

2.3 需要把被测化合物和阳性对照的化合物配置成2mM的溶液,待用；

2.4 配置20%乙醇溶液，待用。

3. 实验步骤

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3.1 首先打开空气浴摇床，设置成37℃，转速为150rpm/min；编写好96孔板的纸质记录；

3.2 根据实验的量算好所需要的半透膜数量，并用纯水将半透膜浸泡60min；纯水的浸泡时间到之后，将废液倒出，把透析膜分开，再用20%乙醇浸泡20min；20%乙醇浸泡的时间到之后，将废液倒出，最后再用PB溶液浸泡20min；

3.3 用DMSO溶液将2mM的储备液稀释至0.4mM溶液，待用；

3.4 用不同的空白基质把0.4mM溶液稀释到2μM溶液，混匀待用；

3.5 将浸泡好半透膜安装在HTDialysis装置上；以上工作都完成好后，开始加样品。Dialysis每个孔中有两侧，上面一侧加150μL 的2μM溶液，则另一侧加150μL 的Blank PB溶液（每个样品需要做3个平行样）； 

3.6 将加样完成的HTDialysis放在已经预热好的空气浴中孵育6h；

3.7 乙腈沉淀

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3.7.1 根据写好的96孔板纸质记录，在对应的孔位中加入样品。C0（T0）是在2μM溶液的基质中取出50μL和50μL Blank PB溶液，再加入400μL含有内标的乙腈沉淀（需要做3个平行样）； 

3.7.2 达到孵育时间后，在血浆端取出50μL样品加入96-孔板，再加入50μL空白PB缓冲溶液，作为结合端，从平衡透析后的PB溶液端取出50μL只96-孔板，再与50μL空白基质混合。向96孔板中加入400μL含有内边的乙腈蛋白沉淀；

3.8 在4℃、转速为4000rpm/min的条件下离心20分钟，最后取150μL上清与150μL 0.1% 甲酸水复溶；

3.9 在LC MS/MS 仪器中进行样品分析。

4. 实验结果

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4.1 数据分析

4.1.1 Fu%= 100 * Cbuffer / Cplasma

4.1.2 回收率= (Cbuffer + Cplasma)/C0 x100，其中 Cbuffer 是测试透析后缓冲液中的浓度 ；Cplasma是测量透析后血浆中的浓度；C0是透析前血浆溶液的浓度。

4.1.3 注明：恢复应该是100%，如果回收率偏离100%，可能表明与透析设备结合，在血浆或溶解度问题中降解。